更新時(shí)間：2024-09-26
載體構(gòu)建克隆（vectorconstruction），為把DNA分子運(yùn)送到受體細(xì)胞中去，必須尋找一種能進(jìn)入細(xì)胞、在裝載了外來(lái)的基因片段后仍能照樣復(fù)制的運(yùn)載體。理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒（plasmid），在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。載體構(gòu)建即是構(gòu)建含外源DNA的質(zhì)粒。
載體構(gòu)建克隆（vectorconstruction）是分子生物學(xué)研究常用的手段之一。依賴于限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和其它修飾酶的作用，分別對(duì)目的基因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。載體構(gòu)建主要包括已有載體多克隆位點(diǎn)MCS的改造和已有載體啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、篩選標(biāo)記等功能元件的改造。載體構(gòu)建完成后可利用PCR原理進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
載體構(gòu)建克隆實(shí)驗(yàn)步驟：
1）引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增目的片段
2）酶切目的片段與載體
3）連接或重組
4）載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化
5）涂板
6）挑取克隆酶切或PCR鑒定
7）載體構(gòu)建測(cè)序驗(yàn)證
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